Dithiothreitol (DTT) הוא חומר מפחית נפוץ, הידוע גם בתור התוסף הירוק החדש.זוהי תרכובת אורגנית מולקולרית קטנה עם שתי קבוצות מרקפטן (-SH).בשל תכונותיו המפחיתות ויציבותו, נעשה שימוש נרחב ב-DTT בניסויים בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית.
התפקיד העיקרי של DTT הוא הפחתת קשרי דיסולפיד בחלבונים וביומולקולות אחרות.הקשר הדיסולפיד הוא חלק חשוב מקיפול ויציבות חלבונים, אך בתנאים ניסיוניים מסוימים, כגון ניתוח SDS-PAGE ניתן להפחתה, ריקומבינציה וקיפול חלבונים, יש צורך להפחית את הקשר הדיסולפיד לשתי קבוצות תיול כדי לפענח את המבנה המרחבי של החלבון.DTT יכול להגיב עם קשרי דיסולפיד כדי לצמצם אותם לקבוצות מרקפטן, ובכך לפתוח את המבנה המרחבי של החלבון ולהקל על הניתוח והתמרן.
ניתן להשתמש ב-DTT גם כדי להגן על פעילות האנזים ויציבותם.בחלק מהתגובות המזרזות אנזים, פעילות האנזים עלולה להיות מופחתת על ידי המחמצן.DTT יכול להגיב עם חומרי חמצון כדי להפחית אותם לחומרים בלתי מזיקים, ובכך להגן על הפעילות והיציבות של האנזים.
בהשוואה לחומרים מפחיתים מסורתיים כגון β-מרקפטואתנול (β-ME), DTT נחשב לחומר מפחית בטוח ויציב יותר.הוא לא רק יציב בתמיסה מימית, אלא גם שומר על תכונותיו המפחיתות בתנאי טמפרטורה גבוהים וחומצה-בסיס.
השימוש ב-DTT פשוט יחסית.באופן כללי, DTT מומס במאגר מתאים ולאחר מכן מתווסף למערכת הניסוי.הריכוז האופטימלי של DTT צריך להיקבע בהתאם לניסוי הספציפי, והוא משמש בדרך כלל בטווח של 0.1-1mM.ריכוזים נמוכים יותר יכולים להפחית השפעות שליליות על צמיחת תאים ויכולים להפחית ציטוטוקסיות עקב ביטוי יתר של חלבוני המטרה.ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לעומס מטבולי מוגזם של התא, להשפיע על צמיחת התאים ויעילות הביטוי.
הדרך לקבוע את הריכוז האופטימלי יכולה להיות להעריך את רמת הביטוי של חלבון המטרה על ידי ביצוע בדיקות אינדוקציה של IPTG בריכוזים שונים.ניתן לבצע בדיקות תרבית בקנה מידה קטן באמצעות טווח של ריכוזי IPTG (למשל 0.1 מ"מ, 0.5 מ"מ, 1 מ"מ וכו') וניתן להעריך את השפעת הביטוי בריכוזים שונים על ידי זיהוי רמת הביטוי של חלבון המטרה (למשל מערבי זיהוי כתם או פלואורסצנטי).על פי תוצאות הניסוי, הריכוז עם אפקט הביטוי הטוב ביותר נבחר כריכוז האופטימלי.
בנוסף, אתה יכול גם לעיין בספרות הרלוונטית או לניסיון של מעבדות אחרות כדי להבין את טווח ריכוזי ה-IPTG הנפוץ בתנאי ניסוי דומים, ולאחר מכן לבצע אופטימיזציה ולהתאים בהתאם לצרכי הניסוי.
חשוב לציין שהריכוז האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למערכות ביטוי שונות, חלבוני מטרה ותנאים ניסיוניים, ולכן עדיף לבצע אופטימיזציה על בסיס כל מקרה לגופו.
לסיכום, DTT הוא חומר מפחית נפוץ שניתן להשתמש בו להפחתת קשרי דיסולפיד בחלבונים וביומולקולות אחרות וכדי להגן על פעילות האנזים ויציבותם.נעשה בו שימוש נרחב בניסויים בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית.
זמן פרסום: 28-2023 בספטמבר