דיתיותרייטול (DTT) הוא חומר מחזר נפוץ, המכונה גם התוסף הירוק החדש. זוהי תרכובת אורגנית מולקולרית קטנה עם שתי קבוצות מרקפטן (-SH). בשל תכונות המחזרות והיציבות שלה, DTT נמצא בשימוש נרחב בניסויים ביוכימיים וביולוגיה מולקולרית.
התפקיד העיקרי של DTT הוא להפחית קשרי דיסולפיד בחלבונים ובביומולקולות אחרות. קשר הדיסולפיד הוא חלק חשוב בקיפול ויציבות חלבונים, אך בתנאים ניסויים מסוימים, כגון ניתוח SDS-PAGE רדוקסיבי, רקומבינציה וקיפול חלבונים, יש צורך להפחית את קשר הדיסולפיד לשתי קבוצות תיול כדי לפענח את המבנה המרחבי של החלבון. DTT יכול להגיב עם קשרי דיסולפיד כדי להפחית אותם לקבוצות מרקפטן, ובכך לפתוח את המבנה המרחבי של החלבון ולהקל על הניתוח והתמרון.
DTT יכול לשמש גם להגנה על פעילות ויציבות האנזים. בתגובות מסוימות המזורזות על ידי אנזים, פעילות האנזים עשויה להיות מופחתת על ידי החמצון. DTT יכול להגיב עם מחמצנים כדי להפוך אותם לחומרים לא מזיקים, ובכך להגן על פעילות ויציבות האנזים.
בהשוואה לחומרי חיזור מסורתיים כמו β-מרקפטואתנול (β-ME), DTT נחשב לחומר חיזור בטוח ויציב יותר. הוא לא רק יציב בתמיסה מימית, אלא גם שומר על תכונות החיזור שלו בטמפרטורה גבוהה ובתנאי חומצה-בסיס.
השימוש ב-DTT הוא פשוט יחסית. באופן כללי, DTT מומס בחומר בופר מתאים ולאחר מכן מוסיף למערכת הניסויית. יש לקבוע את הריכוז האופטימלי של DTT בהתאם לניסוי הספציפי, והוא משמש בדרך כלל בטווח של 0.1-1mM. ריכוזים נמוכים יותר יכולים להפחית השפעות שליליות על צמיחת תאים ויכולים להפחית ציטוטוקסיות עקב ביטוי יתר של חלבוני מטרה. ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לעומס מטבולי מוגזם על התאים, דבר המשפיע על צמיחת התאים ויעילות הביטוי.
הדרך לקבוע את הריכוז האופטימלי יכולה להיות הערכת רמת הביטוי של חלבון המטרה על ידי ביצוע בדיקות אינדוקציה של IPTG בריכוזים שונים. ניתן לבצע בדיקות תרבית בקנה מידה קטן באמצעות מגוון ריכוזי IPTG (למשל 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM וכו') וניתן להעריך את אפקט הביטוי בריכוזים שונים על ידי גילוי רמת הביטוי של חלבון המטרה (למשל, בדיקת Western blot או גילוי פלואורסצנציה). בהתאם לתוצאות הניסוי, נבחר הריכוז עם אפקט הביטוי הטוב ביותר כריכוז האופטימלי.
בנוסף, ניתן גם לעיין בספרות הרלוונטית או בניסיון של מעבדות אחרות כדי להבין את טווח הריכוזים הנפוץ של IPTG בתנאי ניסוי דומים, ולאחר מכן לבצע אופטימיזציה ולהתאים בהתאם לצרכים הניסוייים.
חשוב לציין כי הריכוז האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למערכות ביטוי שונות, חלבוני מטרה ותנאי ניסוי, לכן עדיף לבצע אופטימיזציה על בסיס כל מקרה לגופו.
לסיכום, DTT הוא חומר מחזר נפוץ שניתן להשתמש בו להפחתת קשרי דיסולפיד בחלבונים ובביומולקולות אחרות ולהגנה על פעילות ויציבות האנזימים. הוא נמצא בשימוש נרחב בניסויים ביוכימיים וביולוגיה מולקולרית.
זמן פרסום: 28 בספטמבר 2023