IPTG (איזופרופיל-β-D-תיוגלקטוזיד) הוא אנלוג של סובסטרט β-גלקטוזידאז, שהוא בעל יכולת השראה גבוהה. תחת השראה של IPTG, המשרה יכול ליצור קומפלקס עם חלבון המדכא, כך שהקונפורמציה של חלבון המדכא משתנה, כך שלא ניתן יהיה לשלב אותו עם גן המטרה, וגן המטרה מתבטא ביעילות. אז כיצד יש לקבוע את ריכוז ה-IPTG במהלך הניסוי? האם ככל שגדול יותר, כך טוב יותר?
ראשית, בואו נבין את עקרון האינדוקציה של IPTG: אופרון הלקטוז (אלמנט) של E. coli מכיל שלושה גנים מבניים, Z, Y ו-A, המקודדים β-גלקטוזידאז, פרמאז ואצטילטרנספראז, בהתאמה. lacZ מפריק לקטוז לגלוקוז וגלקטוז, או לאלו-לקטוז; lacY מאפשר ללקטוז בסביבה לעבור דרך קרום התא ולהיכנס לתא; lacA מעביר את קבוצת האצטיל מאצטיל-CoA ל-β-גלקטוזיד, מה שכולל הסרת אפקט רעיל. בנוסף, יש רצף פעולה O, רצף התחלתי P וגן רגולטורי I. קוד הגן I הוא חלבון מדכא שיכול להיקשר למיקום O של רצף האופרטור, כך שהאופרון (מטא) מדוכא ומכבה. יש גם אתר קישור לחלבון מפעיל גן קטבולי - אתר קישור CAP במעלה הזרם של רצף ההתחלה P. רצף P, רצף O ואתר קישור CAP יחד מהווים את האזור הרגולטורי של אופרון lac. הגנים המקודדים של שלושת האנזימים מווסתים על ידי אותו אזור רגולטורי כדי להשיג ביטוי מתואם של תוצרי גנים.
בהיעדר לקטוז, אופרון ה-lac (meta) נמצא במצב של דיכוי. בשלב זה, מדכא ה-lac המתבטא על ידי רצף I תחת שליטת רצף הפרומוטר PI נקשר לרצף O, מה שמונע מ-RNA פולימראז להיקשר לרצף P ומעכב את תחילת התעתוק; כאשר לקטוז נוכח, ניתן להשרות את אופרון ה-lac (meta). במערכת אופרון (meta) זו, המעורר האמיתי אינו הלקטוז עצמו. לקטוז נכנס לתא ומזורז על ידי β-גלקטוזידאז כדי להפוך לאלולקטוז. האחרון, כמולקולת מעוררת, נקשר לחלבון המדכא ומשנה את קונפורמציה של החלבון, מה שמוביל לניתוק החלבון המדכא מרצף O ולתעתוק. לאיזופרופילתיוגלקטוזיד (IPTG) יש את אותה השפעה כמו אלולקטוז. זהו מעורר חזק מאוד, שאינו מתפרק על ידי חיידקים והוא יציב מאוד, ולכן הוא נמצא בשימוש נרחב במעבדות.
כיצד לקבוע את הריכוז האופטימלי של IPTG? קחו לדוגמה את חיידקי האי קולי.
זן E. coli BL21 שעבר הנדסה גנטית, המכיל את pGEX הרקומביננטי החיובי (CGRP/msCT), הוכנס לתמיסה נוזלית LB המכילה 50 מיקרוגרם·מ"ל-1 אמפר, וגודל למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. התרבית הנ"ל הוכנסה ל-10 בקבוקים של 50 מ"ל תמיסת LB טרייה המכילה 50 מיקרוגרם·מ"ל-1 אמפר ביחס של 1:100 עבור תרבית התפשטות, וכאשר ערך ה-OD600 היה 0.6~0.8, הוסף IPTG לריכוז הסופי. הוא 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 מילימול·ל-1. לאחר אינדוקציה באותה טמפרטורה ובאותו זמן, נלקח ממנה 1 מ"ל של תמיסת החיידקים, ותאי החיידקים נאספו באמצעות צנטריפוגה ועברו SDS-PAGE כדי לנתח את השפעת ריכוזי IPTG שונים על ביטוי חלבונים, ולאחר מכן לבחור את ריכוז ה-IPTG עם ביטוי החלבון הגדול ביותר.
לאחר ניסויים, יתגלה שריכוז ה-IPTG אינו גדול ככל האפשר. הסיבה לכך היא של-IPTG יש רעילות מסוימת לחיידקים. חריגה מהריכוז גם תגרום להריגת התא; ובאופן כללי, אנו מקווים שככל שיותר חלבון מסיס מתבטא בתא, כך ייטב, אך במקרים רבים כאשר ריכוז ה-IPTG גבוה מדי, תיווצר כמות גדולה של תכלילים בגוף, אך כמות החלבון המסיס יורדת. לכן, ריכוז ה-IPTG המתאים ביותר לרוב אינו ככל שגדול יותר טוב, אלא ככל שהריכוז נמוך יותר.
מטרת האינדוקציה והטיפוח של זנים מהונדסים גנטית היא להגדיל את תפוקת חלבון המטרה ולהפחית עלויות. ביטוי גן המטרה אינו מושפע רק מגורמי הזן עצמו ופלסמיד הביטוי, אלא גם מתנאים חיצוניים אחרים, כגון ריכוז המעורר, טמפרטורת האינדוקציה וזמן האינדוקציה. לכן, באופן כללי, לפני ביטוי וטיהור של חלבון לא ידוע, עדיף לחקור את זמן האינדוקציה, הטמפרטורה וריכוז ה-IPTG על מנת לבחור את התנאים המתאימים ולהשיג את תוצאות הניסוי הטובות ביותר.
זמן פרסום: 31 בדצמבר 2021